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生物負荷測試
生物負荷：制藥與醫材安全的關鍵角色
生物負荷 (Bioburden)，也稱為生菌數或負荷菌，通常指的是產品、原材料或表面上存在的活體微生物總數量 (如細菌、真菌、病毒等)。它能有效評估和控制產品的微生物含量，不僅是確保產品質量的基石，更是保障患者與消費者安全的關鍵。
為什么生物負荷測試很重要?
生物負荷測試 (Bioburden testing)，又稱為生菌數測試 (total viable count, TVC) 或微生物限度（量)測試 (microbial limit testing)，是制藥與醫療產業中關鍵的質量控制過程 (quality control, QC)，用于偵測及量化產品在滅菌前的活體微生物含量，能夠反映原料質量、生產流程潔凈度、污染控制狀況，并作為制定滅菌參數及驗證滅菌效果的依據。
全球主要法規機構，如美國食品藥品監督管理局 (FDA) 和國際標準化組織 (ISO)，都明確要求需執行生物負荷測試。例如：
· ISO 11737-1：被廣泛用作醫療器材的生物負荷測試標準，并被歐盟醫療器材法規 (EU MDR) 和 美國食品藥物管理局 (FDA 510 (k)) 認可為共識標準。
· 美國藥典USP<61>,<62>,<1115>：涵蓋非無菌產品 (nonsterile products) 微生物限度與控制策略。
生物負荷測試被廣泛應用于醫療器材、制藥、生物制劑和食品與保健品等高風險產業，做為確保產品安全與法規合規的關鍵步驟。
生物負荷測試一般在最終滅菌程序 (terminal sterilization) 前、或在無菌制程 (aseptic processing) 中「無菌過濾或充填步驟」前進行。測試結果所反映的微生物含量，即為整體制程潔凈度的指標。因此，生物負荷測試被視為制程潔凈驗證與污染控制策略中的關鍵步驟，其代表意義如下：
· 滅菌策略設定：
微生物的數量及類型會直接影響最終滅菌的有效性。如果生物負荷過高，即使按照標準流程進行滅菌，也可能無法wanquan殺死所有微生物。因此，生物負荷水平越低，產品越容易滅菌。
· 質量管理及控制：
透過定期監測生物負荷水平能確認制程潔凈度是否穩定、指出制程中的破口，并且使最終產品的微生物含量符合規范范圍內。
· 風險評估：
生物負荷有助于評估產品對患者或消費者的潛在感染風險。特別是醫療器材，若無法有效控制生物負荷，可能導致醫療相關感染 (Healthcare-associated infections, HAIs)。其特性分析有助于了解內毒素 (endotoxin) 的存在，即使滅菌成功，部份細菌仍會釋出內毒素，對患者健康造成潛在風險。
· 法規要求：
許多國家和地區的法規，例如 ISO 11737-1，都要求醫療器材和藥品制造商定期進行生物負荷測試，以符合相關的質量和安全標準。
生物負荷的來源是什么? 如何控制負荷菌 (bioburden control) ?
微生物 (microbial) 可透過多種管道進入產品或原料中。從原物料、人員、設備，乃至整個制造過程，都必須透過嚴格監控，使滅菌程序發揮最大功效，制成使用安全無虞的產品。
常見的生物負荷來源及控制方式如下表所示：
| 來源 | 控制方式 |
| 原材料 | 對原材料進行微生物檢測和控制 |
| 制造環境 | 維持潔凈的生產環境，例如：使用無塵室、空氣過濾系統等 |
| 人員 | 穿著無菌服裝，并遵守嚴格的衛生程序 |
| 設備與工具 | 定期對設備和工作表面進行cedi清潔和消毒 |
| 制造過程 | 遵守無菌操作規范，并選擇產品合適的滅菌方法 |
常見的生物負荷試驗流程及方法？
1. 收集樣品與處理：
依檢品之物理特性選用適用的前處理方式，取得待測檢液。若無適用方法，則應建立適當之替代序程。
| 樣品 | 檢液配制 | |
| 水溶性檢品 | 以適當緩沖液或培養基溶解 | |
| 非油性不溶于水檢品 | 以適當緩沖液或培養基溶解，可添加界面活性劑 | |
| 油性檢品 | 檢品溶解于適當酯類溶劑，再以預熱稀釋液稀釋檢品 | |
| 噴霧式液體/固體檢品 | 將容器中檢品移入微孔濾膜過濾裝置 | |
| 貼片檢品 | 具有黏性之面朝上放在無菌容器中，覆蓋無菌多孔材料，再將貼布移入適當稀釋液中，振蕩至少30分鐘 |
2. 選擇適合的測試方法：
為了量化負荷菌，目前主流有四種定量分析方法，包含微孔濾膜過濾法 (Membrane Filtration Method)、傾注培養法 (又稱混合稀釋法，Pour Plate Method)、表面涂布法 (又稱涂抹法，Spread Plate Method) 以及多重試管法 (又稱最確數法，Most-Probable-Number, MPN)，請根據檢液特性選用適合的測試方法：
| 微孔濾膜過濾法(Membrane Filtration Method) | 培養皿法 / 平板法 (Plate Count Methods) | 多重試管法 (Most-Probable-Number, MPN) | ||
| 傾注平板法 (Pour Plate Method) | 表面涂布法 (Spread Plate Method) | |||
| 原理 | 檢液以 0.45 μm 濾膜過濾后，將濾紙置于培養基上，進行培養 | 將檢液與未凝固之培養基一起倒入培養皿中，進行培養 | 將檢液涂抹于培養基中，進行培養 | 將檢液進行至少3個連續10倍之序列稀釋，進行培養 |
| 適合樣品 | 可過濾之大量液態、生物負荷較低的樣品 | 無法過濾之樣品，如凝膠、黏膠物質等 | 無法過濾之少量樣品 | 生物負荷極低的產品 |
| 適用熱敏感物質 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 準確度 | 高 | 高 | 高 | 低 |
| 培養時間 | 約 5~7 天 | 約 3~7 天 | 約 3~7 天 | 約 3~7 天 |
| 結果單位 | 菌落形成單位 (CFU) | 菌落形成單位 (CFU) | 菌落形成單位 (CFU) | 依最確數表推估 |
*
一般認為多重試管法 (MPN) 是最不準確的方法，因此本法僅于無其他方法適用時才予選用。
3. 結果判定：
根據試驗結果判定產品是否符合法規標準，或用以評估最終滅菌所需之水平。
其中，微孔濾膜過濾法不僅是最常見的生物負荷檢測方法之一，也可以移除檢體中的干擾物質。若待測樣品中含有抑制微生物的生長與繁殖的成分，如抗菌劑 (antimicrobial agent) 或其他具抑菌活性 (antibacterial activity) 的成分，可能會導致檢測結果出現偽陰性 (即樣品中實際存在微生物，但因生長受抑制而未被檢出)。因此，當檢體特性適合以微孔濾膜過濾法操作時，該方法常被視為進行生物負荷試驗的shouxuan技術。其方法是將檢液通過 0.45 μm 的濾膜，捕捉大于孔徑的微生物，再將濾膜轉置至適當培養基中培養，觀察菌落生長情形。
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「生物負荷試驗 」與「 無菌試驗 」的差異?
生物負荷試驗 (bioburden testing) 與無菌試驗 (sterility testing) 是醫療器材和制藥行業中，確保產品無菌性的兩個不同但相關的測試，其目的、執行時機和方法有所不同。
| 生物負荷試驗 (bioburden testing) | 無菌試驗 (sterility testing) | |
| 目的 | 量化并監控制程中的活體微生物總量 | 確定最終產品的無菌性 |
| 執行時機 | 產品最終滅菌前的制程中設立檢查點 | 產品經最終滅菌后 |
| 操作環境 | 一般層流柜 (laminar flow) | 無菌檢測隔離器 (Isolator) |
| 潔凈度 Class 100 (a ji) | ||
| 測試方法 | 微孔濾膜過濾法 傾注平板法 表面涂布法 多重試管法 | 微孔濾膜過濾法 直接接種法 |
| 測試對象 | 未經滅菌前的產品 非要求無菌之產品 | 最終產品 要求無菌之產品 |
| 樣器類型 | 藥品 (固體及液體) | 藥品 (固體及液體) 醫療器材 |
| 測試結果 | CFU 數值 (微生物含量) | 是/否無菌 |
| 結果應用 | 評估滅菌劑量和參數；微生物監測和趨勢分析、制程風險評估 | 驗證產品無菌性，最終放行產品的依據之一 |
| 標準依據 | ISO 11737-1 USP<61> USP<62> | ISO 11737-2 USP<71> |
| 中華藥典 | (7007.1) 微生物計數法 (7007.2) 特定微生物檢驗法 | (7001) 無菌試驗法 |
總體而言，生物負荷試驗是預防性和制程控制的工具，用以了解和管理產品在滅菌前的微生物含量信息；而無菌試驗則是驗證性和質量保證的工具，目的為確認最終產品在經過滅菌處理后是否符合無菌要求
應用
1、 醫療器材產業：如手術刀片、導管、縫線、人工關節等
2、制藥產業：無菌注射劑、藥品原料、生物制劑 (疫苗、抗體、細胞治療產品) 等
3、食品產業：食品廠環境監控、水樣監測等
4、化妝品：產品原料
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